ANÁLISIS DE VARIACIÓN SOMÁTICA INTRAINDIVIDUAL EN LA REGIÓN CLUSTER DE MUTACIONES DEL GEN APC EN PACIENTES MEXICANOS CON CÁNCER COLORRECTAL ESPORÁDICO

Abstract

El cáncer colorrectal (CCR) es un problema de salud pública mundial, siendo el tercer tipo de cáncer más frecuente en el mundo. En 2020 ocupó el segundo lugar en mortalidad por tipo de tumor, constituyendo una de las principales causas de morbi-mortalidad en hombres y mujeres del mundo, considerando el estilo de vida y la tendencia demográfica aumentada en adultos mayores. Aproximadamente el 75% de los casos de CCR son esporádicos; su desarrollo es heterogéneo e inicia por la suma de factores ambientales, genéticos y epigenéticos que contribuye en la complejidad de esta patología.

La trasformación maligna de una célula ocurre generalmente por daños al genoma, particularmente en CCR se ha descrito un modelo molecular del inicio de un adenoma temprano y su evolución hacia un carcinoma, mediante una secuencia relativamente lineal de pasos que inician con alteraciones somáticas del gen supresor de tumor APC.

Las alteraciones en este gen causan la disfunción de su proteína la cual forma parte de la vía de señalización celular Wnt-β-catenina, promoviendo indirectamente la transcripción de algunos oncogenes. Por esta razón, APC es considerado como un gen cuya modificación suscita la carcinogénesis. El 63% de las mutaciones somáticas de este gen se encuentran en una región conocida como MCR (por sus siglas en inglés Mutation Cluster Region) considerada el principal hotspot mutacional.

Las variantes somáticas que se han descrito en MCR son ejemplo de lo observado en tejidos tumorales, sin embargo, la diferencia de genotipos para una secuencia genómica determinada que existe entre los tejidos de un mismo individuo y llamada variación somática intraindividual (VSI), ha sido menos descrita.

Cada vez es más la evidencia de que este tipo de variación que se encuentra aumentada en tejido tumoral, conduzca a la variabilidad genética que influencia diferencias de expresión génica entre tejidos y esto se asocie con enfermedades complejas como el cáncer. De esta manera, el análisis de variaciones específicas entre tejidos de un mismo paciente puede ayudar a definir las variantes que inciden en el proceso neoplásico de CCR.

Materiales y métodos: Se analizaron 100 pacientes que aceptaron participar firmando una carta de consentimiento informado, contestando un cuestionario sobre estilo de vida y permitiendo que se tomara muestras de tejido tumoral, tejido adyacente al tumor y sangre periférica. Las muestras fueron colectadas posterior a tratamiento quirúrgico (no se hizo un seguimiento a los pacientes posterior a cirugía en el Hospital Civil de Guadalajara “Dr. Juan I. Menchaca”).

Se extrajo DNAg de las muestras de tejido sólido fresco (tumoral y adyacente) mediante kit High Pure Template Preparation (Roche®) y de sangre periférica mediante método DTAB-CTAB combinado; el DNA se cuantificó por espectrofotometría. La amplificación de la región MCR del gen APC mediante PCR punto final permitió el análisis de variación por secuenciación capilar Sanger entre el tejido tumoral, el tejido normal adyacente al tumor y el tejido sanguineo.

En el estudio se incluyeron 61 donantes de sangre periférica sanos como grupo de referencia para determinar las frecuencias de variantes comunes. Finalmente se realizó un análisis bioinformático para describir las variantes encontradas en la MCR.

Resultados: Se examinaron 100 pacientes con CCR, 63 hombres y 37 mujeres con edad promedio de 60 años. El análisis de concordancia genotípica entre los diferentes tejidos determinó el hallazgo de eventos de VSI en torno a cuatro SNV, dos ya reportados: c.4012C>G y c.4479G>A, y dos novel: NM_000038.6:c.3874A>T (p.Thr1292Ser) y NM_000038.6:c.4425A>G (p.Ala1475 =).

La VSI se encontró en 55 pacientes, al considerar el total de 165 hallazgos de variantes de nucleótido único en los pacientes y 62 eventos de VSI, en este estudio se determinó la frecuencia de VSI en 37.8%.

Se realizó el análisis in silico de todas las variantes para determinar el posible efecto que pueden generar en la estructura de la proteína, en la alteración del corte y empalme o en la regulación del ARNm, y determinar si son posibles causantes de enfermedad. Las variantes c.4425A>G y c.4479G>A se clasificaron como variantes sinónimas mientras que c.3874A>T, c.4012C>G, c.3949G>C se determinaron de tipo missense, estas tres últimas se calcularon como toleradas por el programa SIFT y como benignas por Polyphen-2; finalmente c.4425A>G, c.4012C>G y c.3949G>C se predijeron como posibles causantes de enfermedad por el programa Mutation Taster prediction.

Las variantes más observadas en los pacientes fueron c.4425A>G y c.4479G>A. Sus frecuencias alélicas y genotípicas se identificaron en un grupo de referencia (n=61) y se determinó que la población se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg. No se encontró asociación entre las frecuencias de los SNVs con el CCR, sin embargo, al comparar la VSI observada entre tejidos no tumorales, los pacientes con cáncer de recto exhibieron un mayor riesgo de VSI que los pacientes con cáncer de colon. La VSI para c.4479G>A se asoció con los estadios III-IV del CCR. Por último, se detectaron variaciones relacionadas con el cáncer en el 15% de los tejidos tumorales.

Conclusiones: En el presente estudio, se identificó la VSI en 55 pacientes y el 37.8% de los hallazgos de variantes manifestaron VSI. Encontramos que los pacientes con tumores rectales tenían un mayor riesgo de VSI y que el VSI para la variante c.4479G>A se asoció con los estadios TNM III-IV, lo que podría atribuirse a procesos endógenos o factores ambientales que causan modificaciones precancerosas tempranas en los tejidos.

El 15% del VSI estuvo presente en la MCR del gen APC en tejido tumoral de pacientes con CCR. La selección de este hotspot mutacional fue apropiada para la determinación de variaciones somáticas. Se informó por primera vez de la frecuencia, nomenclatura, características y análisis in silico de dos variantes novedosas.

Gracias a la recolección de tejidos frescos de los pacientes, fue posible hipotetizar el posible origen somático de las variantes encontradas.