Producción de polihidroxialcanoatos por bacterias aisladas de muestras ambientales utilizando diversas fuentes de carbono en un biorreactor

Abstract

El presente trabajo comprende la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) a partir de varias fuentes de carbono por bacterias aisladas de suelo forestal, así como el diseño y caracterización hidrodinámica de un biorreactor airlift para su cultivo. Se aislaron 30 colonias bacterianas capaces de producir polihidroxialcanoatos. De ellas, dos cepas se seleccionaron por su capacidad de sintetizar estos biopolímeros utilizando diferentes fuentes de carbono: glucosa, lactosa, almidón, sacarosa, xilosa y glicerol. Las cepas fueron identificadas como: Achromobacter mucicolens y Stenotrophomonas rhizophila. La acumulación de PHAs (g de PHAs por 100 g de biomasa) por A. mucicolens a partir de las distintas fuentes de carbono fue: 16.9, 15.2, 11.9, 23.5, 31.3 y 12.2 (glucosa, lactosa, almidón, sacarosa, xilosa y glicerol, respectivamente). En el caso de S. rhizophila la acumulación (g de PHAs por 100 g de biomasa) fue de: 12.3, 10.7, 9.2, 13.7, 9.4, 10.9 (glucosa, lactosa, almidón, sacarosa, xilosa y glicerol, respectivamente). A. mucicolens también fue capaz de crecer y acumular polihidroxialcanoatos (g de PHAs por 100 g de biomasa) en distintos residuos: lactosuero, melazas, hidrolizado de agave, nejayote y desechos de pulpa de mango, acumulando 8.3, 7.2, 20.4, 3.3 y 12.6, respectivamente. La confirmación de la síntesis de los PHAs se realizó mediante análisis del polímero extraído de las células por FTIR y RMN (protón). En todos los casos se produjo polihidroxibutirato (PHB), excepto cuando se utilizó S. rhizophila a partir de glicerol, lo cual dio como resultado la síntesis del copolímero polihidroxibutirato-co-hidroxivalerato, P(HBcoHV). Posteriormente, se eligieron las fuentes de carbono en las que se presentó la mayor acumulación de PHAs por cada cepa (S. rhizophila, sacarosa; A. mucicolens, xilosa) y se estudió la producción de copolímeros adicionando precursores (ácido propiónico, valérico, levulínico y hexanoico). Solamente S. rhizophila fue capaz de sintetizar el copolímero P(HBcoHV) al adicionar ácido propiónico o valérico como precursor, esto se confirmó por análisis de RMN (protón). Los polímeros se analizaron por DSC y también se determinó su peso molecular. Se encontró que el PHB sintetizado por A. mucicolens, a partir de las distintas fuentes de carbono, tuvo un rango de punto de fusión entre 162 y 170 °C, una cristalinidad entre 12.6 y 45.7 %, y un peso molecular entre 301 y 741 kDa. Mientras que el producido por S. rhizophila tuvo un punto de fusión entre 164 y 166 °C, una cristalinidad entre 9.5 y 22.7 %, y un peso molecular entre 212 y 225 kDa. En cuanto a la caracterización de los copolímeros de HB y HV, sintetizado por S. rhizophila, se encontró un punto de fusión entre 118 y 165 °C, una cristalinidad entre 13.5 y 33.4 % y un peso molecular entre 200 y 503 kDa. De manera paralela, se diseñó y fabricó un biorreactor airlift en vidrio y acero inoxidable, al cual se le hizo un análisis hidrodinámico utilizando un diseño 2k, teniendo como factores de estudio: flujo de aire, volumen del líquido, distancia en el eje y entre el dispersor de aire, y del tubo de arrastre. Las variables de respuesta medidas fueron: tiempo de recirculación, tiempo de mezclado, área superficial del aire (a partir del tamaño de burbuja), y retención del aire. De la optimización de los factores se determinó que las mejores condiciones para la operación del reactor airlift - considerando el mayor valor de kLa obtenido (4.83 h-1) - fueron: flujo de aire, 1.17 vvm; volumen de líquido, 2320 ml; y distancia del dispersor, 14 mm. Los factores que mostraron el mayor efecto sobre la transferencia de oxígeno fueron el tiempo de mezclado y el área superficial de la burbuja. Además, se realizó la simulación del comportamiento del biorreactor en el programa COMSOL MULTIPHISICS, trabajando con un flujo turbulento con tres diferentes velocidades (0.004, 0.008 y 0.012 m s-1). Utilizando las mismas velocidades, los resultados de la simulación se compararon con los experimentos físicos, encontrando que los valores del simulador fueron menores que los experimentales. Con un flujo de 2.3 l min-1 de aire (0.008 m s-1), los valores obtenidos para la velocidad de ascenso del líquido en la simulación y experimentalmente, fueron 0.23 m s-1 y 0.33 m s-1 respectivamente, mientras que para la velocidad de ascenso del gas fueron 1.10 m s-1 y 1.58 m s-1. Posteriormente se realizó una fermentación en el biorreactor airlift para producir PHAs, utilizando A. mucicolens a partir de medio de cultivo formulado con base a desperdicios de pulpa de mango, y se comparó con los resultados obtenidos con biorreactor de tanque agitado. En el biorreactor airlift la biomasa producida fue de 4.47 g l-1 y el máximo porcentaje de acumulación de PHB fue de 20.96% (g de PHAs por g de biomasa x100), el cual fue mayor en comparación al tanque agitado, 3.94%. Por otro lado, en el biorreactor de tanque agitado se obtuvo una concentración de biomasa ligeramente mayor (5.57 g l-1), aunque en la producción de PHB fue menor que la lograda en el reactor airlift (4.47 g l-1).