Desarrollo de hidrogeles poliméricos y su aplicación en medicina regenerativa

Abstract

El ser humano, a lo largo de la historia, ha buscado la generación artificial de tejidos, órganos o incluso organismos vivos complejos, pareciendo un deseo inalcanzable antes del siglo XX. A finales del siglo XX, los científicos Joseph Vacanti y Robert Langer demostraron que era posible la generación de nuevos tejidos u órganos con imágenes del “auriculosaurus”, un ratón con una oreja humana en su espalda. De este modo, la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa son áreas que han experimentado un gran auge en los últimos años, ya que son campos interdisciplinares que tienen como objetivo combinar andamios mecánicos, células y moléculas bioactivas de modo que puedan crear tejidos funcionales. En la actualidad, ya se han implantado vejigas, pequeñas arterias, injertos de piel y cartílago y se han recreado de manera exitosa en el laboratorio tejidos de órganos complejos como corazón, pulmón e hígado, aunque todavía no han llegado a implantarse en pacientes. Para poder crear los andamios adecuados para regeneración tisular, la ingeniería de tejidos recurre a biomateriales que permiten mimetizar las estructuras y condiciones biológicas de los diferentes tejidos u órganos. Así, los biomateriales, para aplicación en ingeniería de tejido, deben posibilitar el suministro de células y moléculas bioactivas a zonas lesionadas, de tal manera, que se promueva y restaure la función del tejido u órgano dañado. Por ejemplo, la piel y los cartílagos artificiales han sido aprobados por la Agencia de la comida y los fármacos americana (FDA), sin embargo, el uso en pacientes humanos aún es limitado debido a la gran complejidad del sistema final. Un tipo de biomaterial muy utilizado en ingeniería de tejidos es el basado en hidrogeles de biopolímeros naturales a partir de los cuales se pueden crear andamios que imitan la matriz extracelular (MEC) de las células, que es una red macromolecular anisótropa que sirve de andamio para los constituyentes celulares y como estación repetidora para las moléculas de señalización necesarias para el desarrollo, crecimiento y diferenciación celular. Por ello, los hidrogeles deben proporcionar el espacio, estabilidad, estabilidad mecánica y microentorno adecuado en términos de transporte de nutrientes y señalizaciones bioquímicas para la formación y/o reparación de células/tejidos. Resumen La presente Tesis Doctoral pretender aportar un avance en el conocimiento de la síntesis, caracterización y aplicación de hidrogeles de biopolímeros naturales para regeneración de tejidos. De este modo, la Tesis consta de siete Capítulos en los que el primero comenta el estado del arte en la ingeniería de tejidos, particularizando en el uso de hidrogeles para la obtención de andamios 3D biocompatibles. El segundo se adentra en los materiales, métodos sintéticos y técnicas de caracterización de los sistemas obtenidos. Los Capítulos 3, 4 y 5 muestran los resultados de síntesis y caracterización físico-química y termodinámica, así como estudios in vitro de andamios formados por diferentes biopolímeros para su potencial aplicación en medicina regenerativa y el Capítulo 6 muestra los resultados de la estructuración de los andamios a partir del uso de nanopartículas magnéticas. Finalmente, el Capítulo 7 recoge las principales conclusiones que se alcanzan en el trabajo de investigación. Más en concreto, el Capítulo 1, muestra el estado del arte de la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, ahondando en la importancia de estos campos para la superación de muchas limitaciones que existen en la actualidad respecto a la pérdida de funcionalidades de los órganos/tejidos por la edad, enfermedades o traumas. Así, este Capítulo se centra en el uso de hidrogeles como andamios mecánicos para ingeniería de tejidos, ya que presentan propiedades similares a la MEC, una alta biocompatibilidad y biodegradabilidad y bajas respuestas inmunológicas. A lo largo del Capítulo se comenta la clasificación de los hidrogeles en función de su origen, termosensibilidad y tipo de entrecruzamiento. En este Capítulo también se incluirán los biopolímeros sometidos a estudios con una detallada descripción de sus propiedades y motivación de uso. En concreto quitosano, CS, ácido hialurónico, HA, colágeno, Coll y gelatina, Gel. Por otro lado, esos andamios también se utilizarán en Capítulos posteriores como soportes para la inclusión de partículas poliméricas cargadas con fármaco o nanopartículas inorgánicas para su estudio en regeneración/organización anisótropa de lo andamios. Por ello, en este Capítulo también se introducirán las propiedades más importantes de partículas poliméricas de poli(ácido láctico-co- ácido glicólico), PLGA, y nanopartículas superparamagneticas, SPIONs. Finalmente, en este Capítulo se expondrá el estado del arte de la aplicación de este tipo de andamios poliméricos para la formación de estructuras biocompatibles 3D en presencia de SPIONs. En el capitulo 2, se mencionan todos lo materiales utilizados en esta Tesis Doctoral y se describe de manera detallada la metodología para la obtención de los hidrogeles poliméricos con distinta estructura y composición, tanto puros como híbridos, esto es, mezclas de biopolímeros. En concreto, se presenta la síntesis de hidrogeles basados en CS/HA/Coll y Gel/HA. Más en detalle, los hidrogeles de CS/HA/Coll se obtuvieron por autoensamblaje mediante el entrecruzamiento físico de los biopolímeros, mientras que los basados en Gel y HA se obtuvieron, previa metacrilación de los componentes (GelMA, HAMA), por el método químico de fotopolimerización dando lugar a andamios GelMA-HAMA. También se describe la metodología utilizada para la síntesis de las partículas de PLGA, las SPIONs, las partículas de PLGA con el fármaco antiinflamatario, dexametasona, y las SPIONs en su interior, el proceso sintético de embeber las partículas de PLGA cargadas en la matriz polimérica y finalmente el proceso sintético para la obtención de microfibras poliméricas electrohiladas de policaprolactona (PLC). Dentro de las técnicas de caracterización físico-químicas y termodinámicas se incluirá la descripción, entre otras, de las siguientes: gravimetría, densidad aparente, espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), análisis termogravimétrico (TGA), calorimetría diferencia de barrido (DSC), reología, microscopía de electrónica de transmisión y de barrido (TEM y SEM, respectivamente), porosimetría, microtomografía computacional, dispersión dinámica de luz (DLS), medidas electroforéticas, difracción de Rayos X y magnetometría. Finalmente, al final de este Capítulo se describirán los procedimientos para los estudios in vitro. En el capitulo 3, se muestran los resultados obtenidos de la caracterización de hidrogeles puros e híbridos basado en quitosano, colágeno y ácido hialurónico sintetizados por entrecruzamiento físico. En este Capítulo se muestran las propiedades mecánicas, térmicas y biológicas de estos hidrogeles variando el peso molecular y la composición de cada uno de los biopolímeros obtenidos a partir, entre otras, de medidas de FTIR, TGA, reología, SEM, microtomografía computacional o grado de hinchamiento. Las propiedades mecánicas se caracterizaron mediante mediciones de compresión y reología obteniéndose módulos elásticos similares la MEC. También se realizaron estudios de porosidad, grado de hinchamiento y degradación enzimática obteniéndose andamios altamente porosos. Además, se presentan estudios in vitro obteniéndose una buena biocompatibilidad y capacidad de adhesión y proliferación celular. En el capitulo 4, se muestran los resultados obtenidos de la caracterización de hidrogeles puros e híbridos de GelMA y HAMA obtenidos mediante fotopolimerización. A través de la adición de grupos metacrilo en las cadenas de gelatina y ácido hialurónico se obtuvieron hidrogeles con mejores propiedades mecánicas, térmicas y biológicas, respecto a los no modificados. A lo largo de este Capítulo se discuten las propiedades térmicas obtenidas a partir de medidas de TGA y DSC demostrándose que estas mejoran con la adición de los grupos metacrilo, así como sus propiedades mecánicas, por reología, que muestran aumentos de los módulos elásticos conforme se incrementa la concentración de cada uno de los componentes. Sin embargo, los hidrogeles más a atractivos para la regeneración tisular son los hidrogeles híbridos GelMA-HAMA puesto que presentan unas mejores propiedades mecánicas. En este tipo de hidrogeles, se observó que, mediante medidas de SEM y porosimetría, que la porosidad disminuye conforme la concentración de los componentes aumenta. Se presentan también los resultados de su caracterización térmica y grado de hinchamiento y degradación enzimática. En el capitulo 5, se muestra la caracterización de partículas de PLGA mediante DLS y micrografías de SEM, obteniéndose un tamaño de alrededor de 200 nm, altamente hidrófobas y estables en medio acuoso. Se presentan también los resultados de sus propiedades físico-químicas después de la encapsulación del fármaco dexametasona. A lo largo de Capítulo también se muestran las cinéticas de liberación del fármaco. Finalmente, en este Capítulo se presenta un estudio de la biocompatibilidad de los hidrogeles GelMA-HAMA para posteriormente hacer un estudio de prueba de concepto para la diferenciación de células mesenquimales (MSC) en osteoblastos en presencia de partículas de PLGA cargadas con el fármaco y embebidas andamios de GelMA-HAMA con las propiedades físico-químicas adecuadas, previamente obtenidas. En el Capítulo 6, se presenta la caracterización de las nanopartículas magnéticas basadas en óxido de hierro, tanto puras como dopadas con Zinc mediante medidas de TEM, Rayos X y magnetometría. Posteriormente se procede a mostrar la caracterización de las microfibras electrohiladas de policaprolactona (PLC) con respuesta magnética y las partículas de PLGA con SPIONs en su interior. Finalmente, en este Capítulo se muestran los resultados de la generación de hidrogeles anisótropos por dos vías diferentes, una a través de la incorporación de las microfibras electrohiladas magnéticas y otra con la incorporación de las partículas de PLGA magnéticas en hidrogeles de gelatina. Con la aplicación de un campo magnético externo basado en un sistema de imanes de neodimio colocados en paralelo, se procedió al alineamiento de las SPIONs. En el Capítulo 7, por último, se exponen los principales resultados/conclusiones que se alcanzaron en cada uno de los Capítulos presentados en esta Tesis Doctoral.