EFECTO DEL SILENCIAMIENTO DEL RECEPTOR DE INTERFERÓN TIPO 1 SOBRE LA TRANSDUCCIÓN ADENOVIRAL, ESPRESIÓN DEL TRANSGÉN Y RESPUESTA INMUNE DE HEPATOCITOS EN CULTIVO

Abstract

El hígado es uno de los órganos más importantes en el organismo, cumple con diferentes funciones que son indispensables para la vida. El daño crónico al hígado genera en primer instancia fibrosis que conlleva a cirrosis y a carcinoma hepatocelular. En la actualidad no existen terapias eficientes para el tratamiento de la fibrosis hepática. Por otro lado, la terapia génica ha demostrado tener gran potencial para el tratamiento de enfermedades sin una terapia efectiva. Este tipo de terapia consiste en la transferencia de material genético a una célula diana con el fin de reparar una función perdida, incorporar una nueva o suprimir una función que esté ocasionando un daño. En la terapia génica se utilizan vectores tanto virales como no virales de los cuales los adenovirus son hoy en día los vectores más utilizados. Sin embargo, la gran desventaja que presentan estos vectores es que son altamente inmunogénicos, provocando una respuesta inmune exacerbada que puede ser peligrosa para la integridad del hospedero. Esta respuesta es causada principalmente por la expresión de genes antivirales desencadenados por la cascada de señalización del interferón de tipo I (IFN-I) induciendo un estado antiviral que termina con la eliminación de los vectores y de las células transducidas. Objetivo: Evaluar el efecto del silenciamiento de la subunidad 1 del receptor de interferón tipo 1(IFNAR1) a través de una molécula de shARN anti- IFNAR1 sobre el porcentaje de transducción adenoviral, la expresión del transgén y la respuesta inmune en hepatocitos en cultivo. Metodología: El diseño de los 4 shARN complementarios a IFNAR1 (shARNIFNAR1) se realizó mediante la “web tool” Block iT RNAi Designer (Invitrogen), la construcción se realizó en el plásmido pENTR®/U6 y la clonación se verificó mediante secuenciación de Sanger. Se seleccionó el diseño más eficiente en la disminución de la expresión relativa (2ΔΔCt) basal de IFNAR1 en células hepáticas huh7, mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR). Posteriormente, cultivos de células huh7 fueron transducidas con un vector adenoviral el cual expresa la proteína verde fluorescente (VAd-GFP) y tratadas con el shARN-IFNAR1 más eficiente. Se realizó extracción total de ARN para medir la expresión génica (RT-qPCR) de las citocinas inflamatorias IFNα, TNFα e IL-6, además de IFNAR1 y extracción total de proteínas para evaluar la expresión proteica mediante western blot de IFNAR1, STAT1 fosforilado y PKR. El porcentaje de transducción adenoviral se analizó mediante citometría de flujo. El cultivo de monocitos fue incubado con los diferentes sobrenadantes de las células transducidas y tratadas con el shARN-IFNAR1 y su activación fue evaluado midiendo el porcentaje de MHC-II por citometría de flujo. Resultados: La transfección de células hepáticas con el shARN anti-IFNAR1 disminuyó la expresión génica de las citocinas inflamatorias IFNα y TNFα, la fosforilación del factor transcripcional STAT1 y la síntesis de PKR. El bloqueo de la señalización de IFN-I mediante el shARN-IFNAR1 resultó en una mayor transducción y expresión del transgén del AdGFP en hepatocitos en cultivo. La incubación de monocitos con el sobrenadante de los hepatocitos transfectados con el shARN y posteriormente transducidos el adenovirus AdGFP disminuyó la expresión de MHC-II en una línea celular de monocitos cuando se compararon con el control transducidos solamente con el AdGFP.