Caracterización molecular del exón 28 del gen VWF en pacientes con Enfermedad von Willebrand del occidente de México

Abstract

Antecedentes: La Enfermedad von Willebrand (EvW) es el trastorno hemorrágico hereditario más común (prevalencia de 0.1%) causada por deficiencias cuantitativas (tipos 1 y 3) o cualitativas (tipos 2) del factor von Willebrand (FvW). El FvW establece interacciones con diferentes proteínas ligando (FVIII, GpIb, colágeno y ADAMTS13) y defectos en los dominios a través de los cuales interacciona con estos ligandos, dan lugar a los subtipos de la EvW. Por otro lado, el fenotipo de la enfermedad es consecuencia de la influencia de múltiples factores ambientales, hormonales y fisiológicos que pueden modificar los niveles de FvW. La escasa disponibilidad de pruebas que analicen las interacciones del FvW con sus proteínas ligando y que aporten más datos bioquímicos dificulta la emisión de un diagnóstico por subtipo de la EvW. El gen que codifica al FvW es VWF de 178 kb de longitud y compuesto por 52 exones. Se han descrito más de 700 variantes, de las cuales aproximadamente el 50% se ubican en el exón 28, por lo que es pertinente iniciar el análisis genético con dicho exón para identificar la variante causal de la EvW. En nuestro país el único estudio molecular de la EvW fue realizado por Melo et al., en la Ciudad de México, en él se analizaron los exones 18, 19, 20, 28, 45 y 52 del gen VWF e incluyeron 34 pacientes pediátricos mestizos mexicanos. Ellos encontraron 10 variantes, en 16 pacientes, donde la mutación más común fue p.G1609R (seis casos), seguida por p.T1635N (dos casos) y 8 variantes en un paciente cada una p.P812L, p.R1308P, p.R1597L, p.E1447Q, p.I1628T, p.P2781S, p.S1285F y p.Y1584C. Considerando la escasa información sobre las variantes causales de EvW en población mexicana es de interés realizar el presente estudio. Objetivo: Realizar la caracterización molecular del exón 28 del gen VWF en pacientes con EvW del Occidente de México. Material y métodos: A cada paciente se le aplicó un cuestionario clínico estandarizado que incluye: antecedentes personales patológicos y heredofamiliares, tiempos de coagulación, tiempo de sangrado de Ivy y conteo plaquetario. A todo participante se le tomó una muestra de sangre periférica a partir de la cual se aisló plasma pobre en plaquetas para realizar las pruebas confirmatorias de la EvW: FVIII:C, antígeno del FvW (FvW:Ag), actividad del FvW

2 por medio del ensayo de cofactor de ristocetina (FvW:RCo) y el análisis de multímeros del FvW como prueba discriminatoria de subtipos de la EvW. Además, se extrajo DNA para la identificación de variantes causales de EvW, que se realizó por medio de secuenciación tipo Sanger del exón 28 del gen VWF. Se calcularon frecuencias de sexo, grupo sanguíneo, severidad clínica y síntomas, así como medias y desviación estándar de las pruebas confirmatorias de la EvW, por último, se calcularon las frecuencias de las variantes benignas identificadas en el análisis genético y fueron comparadas con las frecuencias reportadas en Ensembl de población residente de los Ángeles con ascendencia mexicana para obtener Odds Ratios (OR) e identificar posibles asociaciones con la EvW. Resultados: En total se captaron 149 pacientes con sospecha clínica-bioquímica de EvW, a todos se les realizaron las pruebas confirmatorias y el análisis de multímeros. Con este tamizaje 117 pacientes se excluyeron del estudio molecular (112 no tuvieron la EvW, tres EvW tipo 3 y dos EvW tipo 2N) y 32 pacientes se incluyeron, los cuales fueron clasificados como EvW tipo 1, 2A, 2B y 2. De los 32 pacientes 14 fueron adultos y 18 pediátricos. El promedio de edad de los pacientes adultos fue de 24.7±6.1 años y de pacientes pediátricos fue 11.3±3.25 años; el 59.4% fueron del sexo femenino y el grupo sanguíneo más frecuente fue el tipo O+ (62.5%). La severidad clínica fue moderada en 20 pacientes (62.5%), grave en cuatro (12.5%) y leve en ocho (25%). En general los síntomas más frecuentes fueron equimosis (75%), epistaxis (62.5%) y menorragia (47.3%). En el análisis molecular se encontraron 14 variantes distintas; de las cuales, siete son patogénicas o probablemente patogénicas: p.R1308C, p.V1316M, p.R1374H, p.R1597W, p.R1374C, p.R1315C y p.R1306W. En trece pacientes (10 no relacionados y tres familiares) se detectó la mutación causal de la EvW, todos fueron heterocigotos para alguna de las variantes. Las siete variantes benignas o probablemente benignas fueron: p.W1547=, p.T1381A, p.T1608=, p.D1472H, p.A1555=, p.V1565L, p.D1249=. A pesar de que p.V1565L y p.D1472H han sido catalogadas como benignas, se ha demostrado que la primera favorece la proteólisis del FvW en plasma ocasionando un mayor riesgo de eventos hemorrágicos; y la segunda (p.D1472H) disminuye la respuesta del FvW a la

3 ristocetina empleada en la prueba FvW:RCo, lo que ocasiona una interpretación errónea de la actividad del FvW de unión a plaquetas. Los OR obtenidos demostraron que no hay diferencias en la probabilidad de portar la variante entre el grupo con EvW y la población de referencia sin EvW. El análisis de haplotipos identifico seis haplotipos diferentes en nuestra población analizada y dos pares de loci estuvieron en desequilibrio de ligamiento (rs216310-rs216311, r2=1.0, p= 0.0001; rs1800384-rs1800385, r2=1.0, p= 0.0001). Conclusiones: Con el análisis genético del exón 28 del gen VWF, se identificó variante patogénica en el 40.6% de los pacientes analizados. Las variantes patogénicas identificadas permitieron diagnosticar dos pacientes con EvW tipo 1 grave, cuatro con EvW tipo 2A, uno con probable EvW tipo 2M y seis con EvW tipo 2B, demostrando que en el exón 28 pueden existir variantes causantes de otros subtipos de EvW además de las propias de 2B. Todas las variantes patogénicas identificadas son reportadas por primera vez en población mexicana.