Evaluación de la capacidad de producción de shikimato en la cepa SB24 de Escherichia coli PTS- evolucionada.”

Abstract

Resumen El shikimato, intermediario de la vía del shikimato o compuestos aromáticos, se ha implementado como precursor para la síntesis de compuestos de interés como antibióticos, antivirales, antitumorales, entre otros. Este intermediario se produce de manera natural en algunos organismos como plantas, bacterias, hongos y algunos parásitos a partir de la ruta metabólica del mismo nombre o vía común de compuestos aromáticos. Diferentes grupos de investigación han utilizado a cepas de la bacteria modelo Escherichia coli para la producción de SA. Dentro de las estrategias empleadas en las cepas para la sobre-producción de este compuesto, es la inactivación del sistema PTS, como una estrategia para incrementar la disponibilidad del intermediario de la glicólisis, PEP, el cual es utilizado por PTS como donador de fosfato para la traslocación y fosforilación de glucosa. Sin embargo, la inactivación de PTS resulta en la disminución de la velocidad específica de crecimiento (μ) en las cepas PTS-. Por ende, a partir de una cepa de E.coli PTS-, se realizó un experimento de EAL como una estrategia para la selección de derivadas evolucionadas capaces de crecer en glucosa empleando sistemas alternativos de transporte de glucosa. Esta condición permite la disponibilidad teórica de 2 moléculas de PEP provenientes del catabolismo de una molécula de glucosa en las cepas evolucionadas. A partir de un experimento de EAL con una mutante de E. coli PTS-, denominada PB11, realizada en el grupo de trabajo IVM IBt-UNAM, se obtuvo la cepa evolucionada SB24, la cual se evaluó en este trabajo su capacidad de producción de SA. Las estrategias que se implementaron para la cepa sobre-productora de SA fueron: la inactivación de las enzimas shikimato cinasa I y II, codificados por los genes aroK y aroL para interrumpir el flujo de SA hacia corismato, y la inactivación de la isoenzima piruvato cinasa I, codificado por el gen pykF, para favorecer la acumulación de PEP, uno de los dos precursores de la vía del SA. Así mismo, se sobre-expresaron los genes de la vía del shikimato y la vía de las pentosas fosfato en el plásmido pTrcAro6 que contiene un operón sintético que incluye a los genes aroB, aroGfbr, aroE, aroD, tktA y zwf, que permiten la acumulación de E4P y contrarrestar los cuellos de botella de la vía. Una vez obtenido el fondo genético de interés, se 11 realizaron fermentaciones en cultivo lote en matraces de 250 mL, con 50 mL de medio de producción bajo condiciones de cultivo usadas previamente en la producción de este compuesto. En la evaluación de la producción, se obtuvieron desde 8.4 hasta 9.8 g/L de SA en las diferentes condiciones evaluadas. En rendimiento molar de SA, se obtuvieron valores desde 0.38 hasta 0.47 molSA/molGLC, este último valor sobrepasó el máximo rendimiento reportado en la literatura (0.42). En cuanto a la productividad, se obtuvieron valores desde 0.27 hasta 0.11 gSA/gDCW-1*h-1, siendo este dato menor con respecto a lo reportado anteriormente. Con este trabajo se corrobora el impacto positivo que tiene la EAL en las cepas de E.coli PTS-, para la selección de cepas de producción de compuestos de interés. Además de los resultados descritos, es de importancia señalar que para el cultivo de la cepa de producción no se requirió de la adición del inductor IPTG para inducir al promotor trc, por lo cual resulta interesante realizar evaluaciones comparativas posteriores, a partir de los resultados obtenidos