Molecular identification of isolates from Beauveria and Metarhizium (Hypocreales) genera and assessment of the genetic diversity of the species B. bassiana and M. anisopliae complex of the state of Colima, Mexico, using SSR markers

Abstract

Los géneros Beauveria y Metarhizium contienen especies de hongos entomopatógenos (HE) que se han utilizado ampliamente como agentes de control biológico (ACB) y en la formulación de bioinsecticidas contra una amplia gama de plagas de insectos. Las técnicas moleculares (ej., los marcadores de secuencias de ADN y huellas genéticas) desempeñan un papel importante en la identificación, clasificación y conocimiento de la diversidad genética de especies de HE, dichas técnicas a menudo requieren un ADN de alta calidad para conseguir ensayos satisfactorios. En este estudio, se compararon diferentes protocolos de extracción de ADN (e.d., métodos comerciales y convencionales en combinación con tres técnicas diferentes de lisis) de especies representativas de HE, incluidos B. bassiana y M. anisopliae, con el fin de obtener ADN de alta calidad (e.d., integridad, pureza y rendimiento) para aplicaciones moleculares posteriores. Después, identificamos 89 aislamientos de los géneros Beauveria y Metarhizium del estado de Colima (México) albergados en la Colección de Hongos Entomopatógenos del Centro Nacional de Referencia de Control Biológico con marcadores moleculares altamente discriminantes. De igual forma, caracterizamos la diversidad genética de las principales especies identificadas de los géneros Beauveria y Metarhizium con marcadores microsatélites (SSR). Los protocolos DNeasy® Plant mini kit y SDS en combinación con la maceración con nitrógeno líquido (e.d., QN y SN) favorecieron significativamente la calidad del ADN extraído de HE, con buen rendimiento, pureza óptima (~1,8) y alto peso molecular (> 20,000 pb). Además, se obtuvieron resultados confiables y altamente reproducibles en la amplificación del factor de elongación 1-α (TEF) y de marcadores moleculares altamente sensibles (e.g., ISSR y AFLP). Se identificaron 44 aislamientos del género Beauveria por medio de un análisis filogenético bayesiano con las regiones TEF y Bloc. Cuarenta y tres aislamientos se agruparon en el clado de B. bassiana, a su vez, se agruparon en dos sub-clados, AFNEO_1 (n = 22; anteriormente definido como un clado de origen Africano y Neotropical) y Bb (n = 21; estrechamente asociado con la cepa de ex tipo ARSEF 1564), mientras que un aislado se identificó como B. pseudobassiana. La diferenciación genética entre los clados AFNEO_1 y Bb se estableció mediante el índice de fijación (FST = 0.493). De acuerdo a los análisis de la región Bloc y SSR, los clados AFNEO_1 y Bb expusieron una alta diversidad genética. Las pruebas de recombinación mostraron una estructura clonal para ambos clados AFNEO_1 (IA= 2.338; ?̅d = 0.142) y Bb (IA = 3.202; ?̅d = 0.187). Por otra parte, 45 aislamientos del género Metarhizium fueron identificados filogenéticamente por la inferencia bayesiana del extremo 5 del factor de elongación 1-α (5TEF) y la región intergénica MzFG534igs. Se identificaron siete especies: M. acridum (n = 26), M. pemphigi (n = 1), y dentro de los clados PARB y MGT: M. anisopliae (N = 7; sensu stricto: n = 2; sensu lato: n = 5), M. brunneum (n = 2), M. guizhouense (n = 2), M. pingshaense (n = 2) y M. robertsii (n = 5). Metarhizium acridum mostró una baja diversidad genética de acuerdo con 12 SSR polimórficos recientemente desarrollados, mostrando cinco genotipos con uno dominante (n = 21). Finalmente, se identificaron 14 genotipos dentro de los clados PARB y MGT acorde al análisis SSR. Este estudio genera información valiosa sobre las especies de Beauveria y Metarhizium presentes en el estado de Colima (Mexico). Asimismo, es un primer acercamiento hacia la diversidad genotípica de las principales especies identificadas de ambos géneros (e.d., B. bassiana, M. acridum y el complejo M. anisopliae) en el estado. Este conocimiento podría contribuir en la selección de un aislado prometedor o un genotipo con alto potencial como ACB o en la formulación de bioinsecticidas contra alguna plaga de insectos específica.