CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA BACTERIANA INTESTINAL POR METAGENÓMICA 16S rRNA EN PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIA COMUN VARIABLE

Abstract

RESUMEN DE PROTOCOLO DE TESIS CON EL TITULO: “CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA BACTERIANA INTESTINAL POR METAGENÓMICA 16S rRNA EN PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIA COMUN VARIABLE”

Carlos Torres Lozano, Departamento de Alergia e Inmunología Clínica, UMAE, HE, CMNO,IMSS. Ana Paola Franco Esquivias, Departamento de Alergia e Inmunología Clínica, UMAE, HE, CMNO,IMSS. María Cristina García de la Peña, Laboratorio de Medicina de la Conservación, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez del Estado de Durango. Marco teórico: La inmunodeficiencia común variable (IDCV) es la inmunodeficiencia primaria sintomática más común, el diagnóstico se realiza en individuos mayores de 2 años con disminución de niveles séricos de Inmunoglobulina G (IgG) abajo de 2 desviaciones estándar para la edad y al menos disminución de los niveles de otra inmunoglobul ina sér ica y en quienes se excluyeron ot ras causas de hipogamaglobulinemia. La microbiota intestinal es un ecosistema dinámico, su alteración o disbiosis se ha asociado al desarrollo de patologías infecciosas, metabólicas, inflamatorias y recientemente, inmunológicas. Los avances en metagenómica han permitido identificar al momento 3.3 millones de bacterias habitando el intestino humano, antes del desarrollo de éstas técnicas de estudio, la mayoría de dichos microorganismos eran incapaces de ser reconocidos por las técnicas de cultivo bacteriano habituales. La microbiota intestinal tiene una relación estrecha con el sistema inmunológico y el proceso de regulación inmune, al momento y en nuestro conocimiento, solo existe un estudio reportado en donde se hable acerca de la importancia de la microbiota intestinal en pacientes con IDCV en donde los resultados mostraron que todos los pacientes con la inmunodeficiencia y con complicaciones de tipo no infecciosas secundarias a la enfermedad, eran portadores de disbiosis. A pesar de dichos resultados, se desconoce a profundidad las características filogenéticas de la microbiota intestinal en éstos pacientes, se desconoce también si los pacientes de nuestro hospital presentan ésta alteración. Justificación: La IDCV es la segunda inmunodeficiencia más común en el adulto con una prevalencia de 1 caso por cada 10 000 habitantes a nivel mundial y en nuestro servicio es la primer causa de inmunodeficiencia primaria. Se sabe que la principal alteración inmunológica en este tipo de pacientes es a nivel de linfocitos B con hipogamaglobulinemia primaria, con las consecuentes comorbilidades infecciosas y no infecciosas. Se sabe de la importancia que la microbiota tiene en los mecanismos de regulación inmune y las repercusiones que tiene la disbiosis en la salud de población sana, sin embargo, se desconoce las características filogenéticas de la microbiota intestinal en pacientes portadores de IDCV, además de que también se desconoce si los pacientes mexicanos de nuestro centro de estudio, con este tipo de inmunodeficiencia primaria tienen disbiosis. Adicionalmente, el uso de nuevas tecnologías a través de la metagenómica como es Secuenciación del gen 16S rRNA para la determinación de la microbiota intestinal en pacientes con IDCV, será importante como parte del inicio que permite entender los mecanismos de interacción entre la microbiota y el sistema inmune y posibles efectos clínicos en pacientes con IDCV, lo cual dará la pauta para iniciar una línea de investigación en donde mas de dos instituciones estén involucradas como lo es IMSS y la Universidad de Durango, además de la colaboración del área clínica y básica en investigación, situación por demás importante. Objetivo: Describir la composición de la microbiota bacteriana intestinal en los pacientes con IDCV. Objetivos específicos: Determinar la abundancia relativa de los taxa bacterianos a nivel phylum, clase, orden, familia, género y especie de la microbiota bacteriana intestinal en los pacientes con IDCV, establecer los géneros y/o especies que se encuentren reportados previamente como de importancia clínica para la salud intestinal, determinar el índice de disbiosis intestinal en los pacientes con IDCV. Material y métodos: Estudio descriptivo transversal, incluyó pacientes con Inmunodeficiencia Común Variable registrados en el servicio de Alergia e Inmunología Clínica, Unidad Médica de Alta Especialidad, Hospital de Especialidades, Centro Médico Nacional de Occidente, Instituto Mexicano del Seguro Social, se contó con el apoyo de la facultad de Ciencias Biológicas, Laboratorio de Medicina de la Conservación de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez del Estado de Durango. Se incluyeron a todos los pacientes mayores de 18 años con IDCV registrados en el departamento de Alergia e Inmunología Clínica, solo nueve pacientes cumplieron con los criterios de inclusión. Toma de muestras: Para la realización del estudio se requiere de una muestra de heces que fue congelada inmediatamente después de su toma a través de dos metodologías diferentes: 1) El paciente que estuvo en condiciones de otorgar la muestra fecal el día que acudió a su consulta: se otorgó un hisopo estéril y un tubo seco no siliconado marca BD Vacutainer, el primer utensilio sirvió para tomar la muestra directamente al salir del ano y el segundo para que ahí fuera depositada. La residente a cargo del proyecto llevó la muestra fecal al área de laboratorio donde se contaba con un refrigerador que fue utilizado para congelar y conservar las muestras recolectadas a una temperatura de -20ºC. 2) Para ell paciente que no puedo otorgar la muestra fecal el día que acudió a la consulta médica, se otorgó del hipo estéril y de un tubo seco no siliconado marca BD Vacutainer para su toma en domicilio, ésta debió de ser tomada un día previo a su siguiente consulta. Posterior a la toma y de manera inmediata debió de ser congelada en un refrigerador convencional, el día de la consulta se transportó la muestra en una hielera con geles congelantes, al llegar a su consulta fue llevada al mismo congelador en el área de laboratorio previamente mencionado. Preparación de las muestras: Se colocaron 0.25 g de materia fecal de cada muestra y se depositaron en tubos para lisis BashingBeadTM con 750 ul de buffer lisante/estabilizador XpeditionTM Zymo ResearchTM. Cada tubo se colocó en un disruptor celular (TerraLyzerTM) para romper las células bacterianas con ayuda de las perlas de sílice contenidas en el tubo lo que permitió que su DNA entre en contacto con el buffer estabilizador; este proceso conservó el material genético a temperatura ambiente y viable hasta por dos semanas según el fabricante. Extracción de DNA: El DNA de cada muestra se extrajo utilizando el kit XpeditionTM Soil/ Fecal DNA MiniPrep de Zymo ResearchTM. Este proceso se llevará a cabo en una campana de flujo laminar UV con todos los protocolos de esterilidad. El DNA extraído de las muestra se corrió en geles de agarosa al 1.2%, la visualización se llevó a cabo en un fotodocumentador GelMaxTM (UVP®).Cuantificación y amplificación del DNA: La cantidad de DNA obtenida a partir de las muestras se midió en un fluorómetro marca Qubit®. Se llevó a cabo la amplificación de las regiones V3 y V4 del gen 16S rRNA, se colocó 1 μl de los productos de PCR en un chip de Bioanalyzer DNA 1000 para verificar el tamaño del amplicón (~550 pb). Se realizó la purificación de los amplicones con perlas Agentcourt® AMPure® XP al 0.8%. Posteriormente, los amplicones se etiquetaron utilizando Nextera XT Index KitTM para la creación de las bibliotecas, siguiendo el protocolo de Illumina (2017b). Se realizaró la purificación de las bibliotecas con perlas Agencourt® AMPure® XP al 1.2%. Se colocó 1 μl de la biblioteca final de algunos productos de PCR seleccionados al azar en un chip de Bioanalyzer DNA 1000 para verificar el tamaño del amplicón esperando un tamaño de ~630 pb. Finalmente, se realizó la cuantificación, normalización (equimolaridad), la agrupación de las bibliotecas y la secuenciación masiva de siguiente generación (MiSeq Illumina® de 2x250 lecturas de final pareado) siguiendo el protocolo para metagenómica 16S (Illumina, 2017a). Análisis bioinformático: Los resultados de la secuenciación se almacenaron en la aplicación digital de Illumina BaseSpace en formato FASTQ. El análisis de las secuencias se realizó en máquina virtual Oracle VM VirtualBox 5.1.14 en la plataforma MGLinux mediante el software bioinformático Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME) v.1.9.0. La selección de OTUs se realizó con el método UCLUST al 97% de similitud; se obtuvo una secuencia representativa para cada OTU y se asignó taxonomía tomando como referencia la base de datos EzBioCloud. Después se construyó la tabla de OTUs en formato biom, se generaron tablas de abundancia relativa de OTUs a nivel de phylum, clase, orden, familia, género y especie con el comando summarize taxa; luego se graficaron los taxa más abundantes en Excel. Adicionalmente, se obtuvieron las tabla de abundancia absoluta de OTUs para el nivel género (L6) y a partir de estos resultados se generaron curvas de rarefacción (no. de secuencias/no. de OTUs) para observar si se logró cubrir la mayor cantidad de diversidad microbiana; esta gráfica se elaboró en PAST 3.15. El índice de disbiosis fue calculado realizando la división entre: (abundancia total de géneros más abundantes / (abundancia total de géneros menos abundantes), haciendo éste proceso para cada uno de los pacientes a estudiar; si el resultado obtenido fue >1 se consideró el diagnóstico de disbiosis. Las variables clínicas cualitativas (disbiosis intestinal, sexo, complicación de la enfermedad y uso de antibióticos profilácticos) se expresaron con porcentajes y frecuencias absolutas. Las variables cuantitativas (edad y tiempo de diagnóstico de la enfermedad) fueron analizadas con medidas de tendencia central y de dispersión de acuerdo a la curva de distribución de los datos numéricos. Recursos e infraestructura: Los recursos para toma y conservación de la muestra son parte del material y recursos disponible en el Instituto Mexicano del Seguro Social, para el procesamiento de la muestra. El cuerpo Académico “Ecología, Biodiversidad y Manejo de Recursos Bióticos” del Laboratorio de Medicina de la Conservación en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Juárez del Estado de Durango cuenta con un laboratorio equipado completamente para realizar la secuenciación del gen 16S rRNA, cada muestra fue realizada sin costo. Experiencia del grupo: El Departamento de Alergia e Inmunología Clínica de la UMAE, HE, CMNO, IMSS, es un hospital de referencia para el manejo de Inmunodeficiencias Primarias, la IDCV es la primer causa de consulta en éste tipo de patologías y es una de las enfermedades en las que se cuenta más experiencia en tanto al manejo primario de la patología como de sus complicaciones. El personal del Laboratorio de Medicina de la Conservación de la Universidad Juárez del Estado de Durango, precedido por la Dra. María Cristina García de la Peña, ha participado en protocolos de investigación a través de la secuenciación del gen 16S rRNA por lo que el conocimiento en su realización e interpretación de resultados es amplio. Actualmente y con ésta tecnología, se encuentran desarrollando varios protocolos de estudio relacionados a la búsqueda de microbiota en distintas especies animales. Resultados: Se estudiaron nueve pacientes (un hombre y ocho mujeres), el promedio de tiempo en diagnóstico de la enfermedad fue de cuatro años con un tiempo promedio de nueve años de evolución, la principal complicación de la enfermedad fue la infecciosa. Todas las muestras obtenidas alcanzaron adecuadamente la asintota en la curva de rarefacción por lo que todas las muestras fueron válidas. Se obtuvieron 11 phyla con predominio de Firmicutes, ocho clases, 24 órdenes, 35 familias, 167 géneros y 183 especies bacterianas. Los géneros principales fueron Blautia, Faecalibacterium y Bifidobacterium. De todas las bacterias encontradas, solo tres han sido consideradas como patógenas para el humano: Fusobacterium, Synergistes y Bartonella. El 55.5% de los pacientes con IDV tuvieron disbiosis intestinal. Discusión y conclusiones: El estudio por metagenómica del gen 16S rRNA es un método novedoso y poco usado en nuestro medio pero que permite identificar microorganismos que no pueden ser identificadas por otro método, en el caso de pacientes con IDCV, éste es el primer estudio que identifica todas los taxa bacterianos que forman parte de la microbiota intestinal en éste grupo de individuos.