UTILIZACIÓN DE UNA ESTRATEGIA DE TERAPIA GÉNICA MEDIANTE Ad- MMP8 PARA INDUCIR REGRESIÓN DE LA FIBROSIS RENAL EN UN MODELO MURINO.

Abstract

Antecedentes: El riñón es el principal órgano excretor y homeostático del cuerpo humano y cualquier proceso que resulte en la pérdida de las nefronas eventualmente progresará a una enfermedad renal crónica (ERC). Una manifestación común de la enfermedad renal crónica es la fibrosis renal, considerada como uno de los factores que desencadena una insuficiencia renal terminal, caracterizada por proliferación celular y un progresivo depósito de matriz extracelular (MEC) principalmente colágena I, III y fibronectina. La degradación de las proteínas de la MEC se lleva a cabo por enzimas proteolíticas denominadas metaloproteinasas de matriz (MMPs) que se encargan del remodelado de la matriz extracelular. Dentro de las MMPs, la MMP-8 puede escindir un amplio rango de sustratos, principalmente colágena tipo I y III. Por otra parte, la Terapia génica es una metodología novedosa que aborda la inserción de material genético en el interior de una célula diana mediante un vector con el objeto de modificar la dotación genética y con ello producir un cambio funcional. Dentro de los vectores más utilizados para la terapia génica se encuentran los adenovirus los cuales presentan varias ventajas sobre los otros vectores como son la facilidad de producción en el laboratorio y que pueden transducir gran cantidad de células. Objetivo general: Evaluar el efecto de una estrategia de terapia génica mediante la administración de Ad-MMP-8 en la regresión de la fibrosis renal en un modelo murino. Material y métodos: A ratas Wistar se les indujo fibrosis renal por medio de la administración con adenina 100 mg/Kg de peso al día mediante cánula orogástrica durante 4 semanas. el grupo control sano solamente recibió vehículo. Una vez establecida la fibrosis y previa anestesia, se administró en el riñón izquierdo 3X1011 PV/rata de adenovirus conteniendo el gen terapéutico MMP8 (Ad-MMP8) o el gen irrelevante GFP (Ad-GFP), otro grupo recibió solo el vehículo. Los animales fueron sacrificados a los 3, 7 y 14 días para la obtención de ambos riñones que fueron diseccionados para la realización de diferentes procedimientos: RT-PCR para el análisis de la expresión de los siguientes genes: Col-1a, TGF-ß1, a-SMA, CTGF, MMP-8, TGFß3, PAX2, IL-1, TNF-a, BMP-7, VEGF). Histología: (Tinción tricrómica de Masson (grado de fibrosis), Hematoxilina y Eosina (inflamación y necrosis), inmunohistoquímica (a-SMA) y ELISA para la determinación de MMP-8 en homogenado de tejido renal y en suero. Así como la obtención de muestras sanguíneas para determinación de pruebas de funcionalidad renal (Urea y creatinina). Resultados: Se estandarizó el modelo de fibrosis renal por nefropatía mediada por la administración de adenina durante 4 semanas donde se encontró un porcentaje de fibrosis del 20%± 4% estadísticamente significativo (p≤0.001) así como un aumento significativo en los niveles de urea y creatinina respecto a la administración de vehículo. También se estandarizó el envío del gen reportero de la “proteína verde fluorescente” (Ad-GFP) por isquemia-reperfusión de la vena renal del riñón izquierdo a 15 min dónde se determina que el porcentaje de transducción a través de la expresión del transgen es de 72.5 ± 5%. Intervención: Se encontró una reducción del porcentaje de fibrosis estadísticamente significativa entre los grupos de ratas tratadas con Ad-MMP-8, Ad-GFP y vehículo a los 14 días posttransducción siendo mayor en el riñón derecho que en el izquierdo. La medición de los niveles de la proteína MMP-8 mediante ELISA mostró que solamente se encontró MMP-8 en las ratas tratadas con Ad-MMP-8 en ambos riñones sin embargo, el trasgen únicamente fue encontrado en el riñón izquierdo de estos animales. En cuanto a las determinaciones de funcionalidad renal se encontró una tendencia no significativa a disminuir creatinina y urea el día 14 ADE+MMP8: BUN 41mg/dL, creatinina 0.4mg/dL en comparación con los grupos de ADENINA: En relación a la expresión génica se encontró una disminución en la expresión de genes profibrogénicos y proinflamatorios en ratas tratadas con MMP8 en comparación con el grupo control con fibrosis así como un aumento en la expresión de genes antifibrogénicos. Conclusiones: El envío de Ad-MMP8 al riñón izquierdo permite la expresión del transgen de la metaloproteinasa 8 con una reducción significativa de la fibrosis renal ocasionada por la administración de Adenina.