Análisis funcional de mutaciones puntuales específicas en los exones 2 y 3 del gen F9 causantes de fenotipo grave de Hemofilia B

Abstract

Antecedentes: La Hemofilia B (HB) es un trastorno hemorrágico causado por una deficiencia o ausencia del Factor IX (FIX) de la coagulación, el cual es codificado por el gen F9; los exones 2 y 3 traducen el propéptido y el dominio Gla (Ácido Gamma-carboxiglutámico), respectivamente; estos dos dominios son esenciales para la actividad de la proteína. Los análisis in silico proveen información útil para predecir la correlación genotipo-fenotipo, sin embargo, no es suficiente para evidenciar cómo se altera el mecanismo de la coagulación1 mientras que el análi.sis in vitro puede ser útil para soportar estas predicciones y confirmar el efecto funcional de las mutaciones en un modelo biológico. Objetivo: Analizar el efecto de l!laciones puntuales específicas en los exones 2 y 3 del gen F9 asociadas a fenotipo grave de HB sobre la estructura y función de la proteína FIX.

Materiales y métodos: Se selecc.aron mutaciones puntuales específicas causantes de fenotipo grave de HB (referidas en las bases de datos http://www.factorix.org/ y https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=F9) que no contaran con un análisis funcional previo. Se rea lizar•on predicción del posible impacto fundo nal de las mutaciones selecciona das sobre el FIX con seis programas disponibles en línea (SIFT, PolyPhen-2, SNAP2, MutationAssessor, PROVEAN y PANTHER). Mediante la prueba exacta de Fisher, se realizó una asociación de la predicción con el fenotipo reportado en las bases de datos y de acuerdo a los resultados estadísticamente significativ-0s1 de las 93 variantes se selecciona ron 8 va ria ntes. Las mutaciones selecciona das fueron inducidas en el DNA complemetario (cDNA) del gen F9con el fragmento del intrón 1 presente en el plásmido pcDNA 3.1 (+/-) mediante mutagénesis dirigida. Posteriormente, los plásmidos portadores con las mutaciones fueron transfectad.os en las célullas HEK 293, HepG2 y HMSC con el fin de producir proteínas mutantes y el FIX tipo silvestre. Se realizaron experimentos de inhibición del tránsito intracelular (Cloruro de amonio (NH4CI), Leupeptina (Leu), N-aceti-leu-leu-Norleucina (ALLN), Brefeldina A (BreA) y Clastolactacistina-lactona (Clasto)] y la actividad del factor FIX. Las comparaciones de los diferentes parámetros a medir entre las proteínas de los tipos silvestre y mutante se anallizaron mediante la prueba de ANOVA usando el programa SPSS. Resultados: A partir de las dos bases de datos de seleccionaron 93 variantes. Los programas SIFT y PolyPhen-2 predijeron que el 83.8%y MutationAssessor el 88% siendo estos programas l!os •que mejor asociaron sus predicciones con ellfenotipo clínico. A partir de estos análisis se selecciona ron 8 variantes (cuatro para el exón 2 p.Glu35Gly, p.Asn38Hi1s, p.Leu41Arg y p.Lys45Asn; cuatro para el exón 3 p.Lys51Glu, IV

El p.Phe55Cys, p.Gllu79Gln y p.Thr84Arg), que cumplieron con los criterios de inclusión para realizar el análi1sis in vitro. Se generaron los modelos tridimensionales de la secuencia del propéptido y el dominio Gla, de l!os cuales se predijeron cambios en la red de puentes de hidrngeno.Se logró inducir cuatro de ocho mutaciones en el vector pcDNA3.1hF91n (cDNA del gen F9 humano con el fragmento del lntrón 1), generando las sustituciones p.Glu35Gly (exón 2), p.Lys51Glu, p.Phe55Cysy p.Glu79Gln (exón 3). De las 3 líneas celulares evaluadas, se seleccionó la línea celular HEK293 como el modelo celular adecuado para la transfección de los vectores. Elanálisis del tránsito intracelular mostró que el FIX silvestre es procesado de forma correcta en presencia de los inhibidores del tránsito celular evaluados y las proteínas con las sustituciones p.Glu35Gly, p.Lys51Glu en presencia de NH4CI aumentaron su concentraClón intracelular; mientlías que1 las proteínas con las sustitudones p.Phe55C.. p.Glu79Gln en presencia de brefeldina A aumentaron su concentración intracelular. Mediante la prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada (TIPa) se observó que en todos los casos las proteínas mutantes aisladas del medio intracelular presentan actividad. Conclu,siones: Las predicciones estructurales de las mutaciones del gen F9 seleccionadas dieron un panorama general del efecto en la actividad de la proteína que fue ampliado por el anállisis in vitro. Las proteínas mutantes p.Glu35Gly y p.Lys51Glu son degradadas principalmente por lisosomas, mientras que p.Phe55Cys, p.Glu79Gln son degradadas en el compartimiento pre-Golgi. Las cuatro proteínas mutantes que no logran ser secretadas y son acumuladas intracelularmente, muestran actividad biológica. Sin embargo. es fundamental!llevar a cabo estudios posteriores para conocer a fond·o el mecanismo por el cual mantienen su actividad.