Determinación del efecto de la expresión del gen celA1 bajo el promotor fuerte hsp60 en el crecimiento en forma planctónica y en biofilm, así como el perfil de monosacáridos de BCG

Abstract

Introducción: El crecimiento de micobacterias en biofilm in vitro se asocia a una mayor tolerancia a los antibióticos comparados con los cultivos planctónicos. La celulosa es un componente característico del biofilm de M. tuberculosis expuestos a DTT in vitro y también encontrado en lesiones in vivo. El gen celA1 de M. tuberculosis que codifica una celulasa participa en la modulación del biofilm, ya que su sobreexpresión puede disminuir la formación del biofilm como su homólogo MSMEG_6752 en M. smegmatis; sin embargo, se desconoce su impacto en el perfil de monosacáridos del biofilm. Objetivo: Determinar el efecto de la expresión fuerte del gen celA1 en el crecimiento de BCG tanto en cultivo planctónico como en biofilm y su perfil de monosacáridos. Materiales y Métodos: La cepa BCG::celA1, derivada de la clonación de celA1 en el plásmido pMV361 para expresarse bajo el promotor fuerte hsp60, y luego ser transformada en M. bovis BCG Pasteur, y la cepa BCG::pMV361 (vector vacío) se cultivaron en medio Middlebrook 7H9/OADC a 37°C a 100 rpm para su forma planctónica y en medio Sauton a 37°C y CO2 al 5% por 2 semanas para su crecimiento en biofilm. Ambas cepas en cultivo planctónico se retaron a 45°C y se buscó CelA1 en extractos proteicos completos por SDS-PAGE. Se cuantificó el biofilm producido por espectrofotometría visible después de teñirlo con cristal violeta, así como la abundancia relativa de monosacáridos contenidos en ambas condiciones de cultivo por HPAEC-PAD. Resultados: BCG::celA1 presentó diferencias en la apariencia del biofilm superficial y el adherido al sustrato, así como en el perfil de monosacáridos, al disminuir la abundancia relativa de glucosamina en el biofilm. Conclusiones: CelA1 afecta el biofilm en la superficie mostrándose más liso, con menos rugosidades pero con bordes más pronunciados y dispersos, así como el contenido de glucosamina, más no afecta la replicación y crecimiento en cultivo planctónico. La disminución del biofilm fue cercana a la significancia. CelA1 podría romper las cadenas de celulosa de la matriz extracelular del biofilm para exponer los polímeros de la pared celular a otras enzimas, lo que explicaría el aumento de glucosamina a partir de polímeros contenidos en el biofilm.